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    如何進行冷凍切片檢測？步驟詳解
    來源： 時間：2024-12-16 10:14:43 瀏覽：3730次

    如何進行冷凍切片檢測？步驟詳解

     

    冷凍切片檢測是一種在病理學和生物科學研究中廣泛使用的技術，它允許快速制備組織樣本以進行形態(tài)學分析、免疫組化或免疫熒光等實驗。

    以下是詳細的步驟介紹，包括從取材到分析的整個過程：

    1. 取材與速凍

    新鮮取材：迅速從生物體中獲取組織樣本，以減少死后變化對組織結構和抗原活性的影響。

    組織處理：將組織塊平放于特制容器內，如軟塑瓶蓋或小盒，直徑約2cm，對于小組織塊可加入OCT（Optimal Cutting Temperature）包埋劑，以保持組織形態(tài)。

    速凍：使用液氮或干冰-丙酮混合物快速冷凍組織，確保組織迅速冰結成塊，減少冰晶損傷。

    2. 切片準備

    恒冷箱切片：將冷凍的組織塊置于切片機的冷凍臺上，調節(jié)至適宜溫度（-15℃至-20℃），使用專用刀片進行切片，厚度通常控制在4-10微米。

    組織貼片：切好的薄片需立即貼附在預冷的載玻片上，確保組織片的完整性和位置固定。

    3. 固定與處理

    固定：切片后，室溫晾干，然后用冷丙酮固定10分鐘，以穩(wěn)定細胞結構和抗原。

    洗滌：用PBS（磷酸鹽緩沖液）洗滌3次，每次5分鐘，去除固定劑。

    抗原修復：對于某些需要抗原修復的實驗，將切片置于特定的修復液（如EDTA）中，通過微波或煮沸處理，恢復被固定劑封閉的抗原位點。

    4. 阻斷與封閉

    內源性酶抑制：使用3%過氧化氫溶液在室溫下避光孵育25分鐘，以減少內源性過氧化物酶的干擾。

    封閉：用BSA（牛血清白蛋白）或正常動物血清在組織周圍畫圈封閉，防止非特異性結合，室溫下封閉30分鐘。

    5. 抗體孵育

    一抗孵育：將切片置于含有適當稀釋的一抗的溶液中，4°C孵育過夜，以確保充分結合目標抗原。

    二抗結合：洗滌去除未結合的一抗后，加入標記的二抗（如HRP或熒光標記），室溫孵育一定時間。

    6. 顯色與染色

    DAB顯色或熒光染色：對于DAB顯色，經(jīng)過二抗處理后，使用DAB試劑顯色，觀察到棕色沉淀即為陽性反應。對于熒光染色，直接觀察熒光信號。

    核染色：通常使用DAPI進行核染色，以提供細胞核的定位信息。

    7. 結果觀察與分析

    干燥與封片：切片干燥后，使用中性樹膠或其他封片劑封片，防止熒光淬滅。

    顯微鏡檢查：在熒光顯微鏡或光學顯微鏡下觀察，記錄圖像，分析抗原分布或細胞結構特征。

    注意事項

    溫度控制：整個過程中，特別是切片和固定步驟，溫度控制至關重要，以避免組織損傷和抗原損失。

    操作精細：每一步操作都需細致，避免組織片的損壞或抗原的非特異性結合。

    標準化流程：確保每一步的條件（如固定時間、抗體濃度）標準化，以提高實驗的可重復性。

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    全部 3小時前 四川
    文字是人類用符號記錄表達信息以傳之久遠的方式和工具。現(xiàn)代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產生書面文字，很多小語種，有語言但沒有文字。文字的不同體現(xiàn)了國家和民族的書面表達的方式和思維不同。文字使人類進入有歷史記錄的文明社會。
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